两种动脉粥样硬化模型制备方法的比较
周程艳，李倩，梁宇璇，国洪宾，赵盈秋
(河北大学药学院河北省药物质量分析控制重点实验室，河北保定)
摘要：目的建立两种动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的模型，并对建立方法进行比较研究。方法SPF级雄性SD大鼠18只，随机分为SD正常组(SDN)和SD模型组(SDM)，SPF级雄性C57BL/6J小鼠12只，ApoE-/-小鼠24只，分为C57BL/6J空白对照组(CN)、ApoE-/-空白对照组(AN)和ApoE-/-模型组(AM)。采用高脂饲料诱导法建立AS模型。比较各组鼠基本情况，检测血清中血脂、炎症因子以及脂肪酸的含量；进行主动脉窦的免疫组化；对实验鼠整体主动脉进行油红O染色以及主动脉根部切片的HE染色。结果模型组(包括SDM、AM组)鼠与正常组(包括SDN、CN、AN组)鼠在体质量、摄食和摄水方面有明显的改变(P0.05)。与正常组相比，模型组鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均明显升高(P0.05)，HDL-C含量明显降低(P0.05)；CRP、MCP-1、IL-1β、IFN-γ、TXB2、DPP-4含量明显升高(P0.05)，PGF-1α和GLP-1水平显著降低(P0.05)；棕榈油酸和亚油酸含量降低(P0.05)，棕榈酸、油酸、硬脂酸的含量升高(P0.05)。模型组鼠主动脉窦中TNF-α的表达升高，StAR、PPAR-γ的表达呈阴性。AM组小鼠的动脉粥样硬化指数(atherosclerosisindex,AI)是SDM组大鼠的1.67倍，SDM组内膜增厚且局部隆起，中膜弹力纤维紊乱，外膜有轻度炎症细胞浸润的现象，呈现早期的AS病理变化，而AM组有大量红色斑块沉积。结论ApoE-/-小鼠的AS病变程度较SD大鼠明显，并且与SD大鼠相比，AS对ApoE-/-小鼠的脏器损伤更小，因此，ApoE-/-小鼠更适合用于构建AS模型。
关键词：动脉粥样硬化；模型制备比较；脂质代谢；炎症反应；HE染色；免疫组化
动脉粥样硬化(atheroscherosis,AS)是导致心血管疾病患者死亡的主要原因之一，严重危害人类的健康[1]，其病变特点为脂质累积、血管腔变狭窄、动脉壁增厚并失去弹性、炎症因子增多等[2]。脂质代谢紊乱既是导致AS的最原始条件，也是AS的主要特征[3]。棕榈油酸、亚油酸、硬脂酸等饱和脂肪酸通过影响血脂的水平加剧血管的炎症反应，不饱和脂肪酸可减少胆固醇含量，预防并抑制AS的发生与恶化。炎症细胞与炎症因子参与了AS发生发展的全过程[4]，可加速AS的形成。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通过促进其他炎症因子合成释放，使AS加重；类固醇激素急性合成蛋白(StAR)通过促进胆固醇的代谢，降低其含量，避免因胆固醇堆积聚集而导致AS的发生；过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)主要调节脂肪代谢，抑制炎症反应；StAR与PPAR-γ均可在血管内皮表达，二者共同作用减轻AS症状。
本实验选择的是易得的C57BL/6J小鼠和与其对应的ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠。C57BL/6J小鼠品系稳定，易于繁殖，且容易形成AS。年利用基因敲除技术成功地复制出ApoE-/-小鼠,该小鼠在普通饲料喂养下也可以形成明显的AS改变，但需要数月的周期，高脂饲料喂养可以在短时间内形成明显的AS改变[5]。
本实验通过使用改进配方的高脂饲料诱导SD大鼠和ApoE-/-小鼠产生AS病变[6]，比较两种造模方法的优缺点，选择出适合研究AS机制的造模方法。
1实验材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
SPF级雄性SD大鼠18只，7周龄，(±20)g。SPF级雄性C57BL/6J大鼠12只，ApoE-/-小鼠24只，7周龄，18～20g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)—。所有涉及动物实验操作程序均经过动物伦理委员会批准(批准号为IACUC-)。
1.1.2试剂和仪器
TNF-α、StAR、PPAR-γ抗体、聚合物辅助剂、辣根酶标记抗兔IgG聚合物、3%H2O2去离子水均购于北京博奥森生物技术有限公司。全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司，型号SynergyHT)，手动轮转式石蜡切片机(美国赛默飞，型号MICROMHMscientific)，显微镜(德国蔡司，型号ZEISSPrimoStARt)，氮吹仪(天津市奥特塞恩斯仪器有限公司，型号MTN-W)，气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司，型号QP)。
基础饲料制备过程：(1)在一个容器中混合大豆油和酪蛋白，另一个容器中混合维生素、矿物质、胱氨酸、胆碱。(2)将两个容器中的混合物在一起均匀混合，之后加入蔗糖和其他物质，最后加入淀粉，遵循少量多次的原则直至混合均匀。(3)将混合好的基础饲料分装、密封，写好日期及名称。
高脂饲料配制：先加热猪油，待猪油温热后加入大豆油、胆固醇、胆酸钠等药物，混匀后加入酪蛋白。其他步骤与基础饲料制作过程相同。
高脂饲料是在基础饲料的基础上添加了猪油、蛋*粉、胆固醇、胆酸盐和丙硫氧嘧啶，每千克高脂饲料Ⅰ分别添加了、20、30、5、2g，每千克高脂饲料Ⅱ分别添加了、0、15、2.5、0g。
1.2方法
1.2.1实验动物分组及动物模型建立
全部实验鼠均饲养于啮齿动物笼中，温度(26±1)℃，相对湿度30%～60%,12h光照，12h黑夜。用基础饲料喂养1周后，按体质量进行随机分组，分组及造模方法如下：(1)18只SD大鼠分为2组，每组9只。①SD正常组(SDN)，基础饲料喂养，腹腔注射生理盐水2mL/kg。②SD模型组(SDM)，高脂饲料Ⅰ喂养，腹腔注射VitD3注射液，第一次60万IU/kg，之后每次10万IU/kg。腹腔注射生理盐水和VitD3注射液从第1周开始后，每隔1周注射1次，直至实验结束。饲养20周。(2)12只C57BL/6J小鼠为C57BL/6J空白对照组(CN)，基础饲料喂养，饲养4周。(3)24只ApoE-/-小鼠分2组，每组12只。①ApoE-/-空白对照组(AN)，基础饲料喂养。②ApoE-/-模型组(AM)，高脂饲料Ⅱ喂养。饲养4周。
对各组实验鼠的状态、体质量、摄食量以及摄水量情况进行观察和记录，每周1次。第4周喂养结束后，各组小鼠禁食不禁水12h，常规消*，摘除小鼠眼球收集血液，分离组织进行称重，剥离心脏和主动脉，计算脏器系数，脏器系数=(脏器质量/体质量)×%,第20周喂养结束后，SD大鼠腹主动脉取血，其他标本取材及脏器系数检测与小鼠相同。
1.2.2检测指标
按照试剂盒说明书的步骤进行血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的检测，在规定的波长下进行读数，并计算动脉粥样硬化指数(atherosclerosisindex,AI)，AI=(TC-HDL-C)÷HDL-C。采用酶联免疫吸附测定法对血清中DPP-4、GLP-1以及炎症因子CRP、MCP-1、IL-1β、IFN-γ、PGF-1α、TXB2进行检测，在规定波长下检测吸光度，计算含量。
1.2.3病理组织学观察
将带有主动脉根部的心脏按常规的乙醇梯度脱水以及二甲苯透明处理后进行石蜡包埋，连续切片，置60℃烘箱中烘干，进行HE染色以及病理分级评分统计[7]。0级：结构正常。1级：内膜有少量泡沫细胞积聚，无明显的突起斑块。2级：内膜可见大量泡沫细胞积聚，有明显的粥样斑块，部分斑块融合成片。3级：内膜表面几乎全被粥样斑块覆盖，斑块内可见组织钙化，斑块底部肌层萎缩变薄。将取得的整根主动脉在实体显微镜下纵向剖开，过程中用生理盐水冲洗血管，防止血管脱水。用70%乙醇溶液冲洗主动脉5min，待乙醇挥发后将其浸入油红O染液中染色15min。用80%乙醇溶液分化3min，洗去附着在主动脉壁上的油红O染液。观察现象，并拍照记录。
将主动脉窦血管进行常规脱水透明，石蜡包埋和切片，将切片在60℃环境中烘烤2h，采用免疫酶细胞化学技术法进行免疫组织化学染色，用辣根过氧化物酶标记，DAB显色。在显微镜下观察，用Image-ProPlus6.0图像分析软件进行分析，计算主动脉窦血管中StAR、PPAR-γ、TNF-α阳性表达。
1.2.4血清中脂肪酸的检测
用甲醇配置1g/L的十七烷酸做内标，取μL血清加入16μL内标混匀，再加入2.5%硫酸-甲醇溶液1mL，80℃水浴加热90min，室温冷却，加入0.9%氯化钠溶液1.5mL和1mL正己烷，摇匀后r/min离心5min，取上层正己烷1mL氮吹干，μL正己烷复溶进样，用气相色谱-质谱计算机联用仪进行分析鉴定，按外标法定量计算各化学成分的含量。
1.3统计学处理
采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，用Image-ProPlus6.0图像分析软件对切片进行分析，Origin86进行图片处理。数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，应用LSD法进行多重比较，所有检验中，以P0.05表示差异有统计学意义。
2实验结果
2.1实验鼠的状况观察
正常组(包括SDN、CN、AN组)鼠精力充沛、活泼爱动、毛发柔顺有光泽、体形健壮，摄食摄水以及排便均正常。模型组(包括SDM、AM组)鼠出现不同程度的精神萎靡，毛发杂乱易脱落且无光泽，身形瘦弱，摄食量降低。与SDM组比较，SDN组大鼠的体质量、摄食量、摄水量和能量摄入量均有明显下降(P0.05)，而AM组与CN、AN组小鼠相比，体质量和能量摄入量明显增加(P0.05)，摄水量有下降的趋势。结果见图1、图2。
A体质量；B摄食量；C能量摄入量；D摄水量
与SDN组比较，aP0.05图1SD鼠的体质量、摄食量、能量摄入量和摄水量
A体质量；B摄食量；C能量摄入量；D摄水量
与CN组比较，aP0.05;与AN组比较，bP0.05图2C57BL/6J和ApoE-/-小鼠的体质量、摄食量、能量摄入量和摄水量
与SDN组相比，SDM组肝脏、肺脏、脑的脏器系数明显升高(P0.05)，脾脏脏器系数明显下降(P0.05)；与CN组相比，AN组肺脏和脑以及AM组小鼠肺脏和脑的脏器系数有所降低(P0.05)，AM组肝脏的脏器系数明显升高(P0.05)；与AN组相比，AM组小鼠肺和脑的脏器系数显著降低(P0.05)，其他脏器系数无显著变化，结果见表1。与SD大鼠相比，AS对ApoE-/-小鼠的脏器损伤更小，ApoE-/-更适合用于构建AS模型。
表1各组脏器系数的比较
与SDN组比较，aP0.05；与CN组比较，bP0.05；与AN组比较，cP0.05
2.2实验鼠血脂水平以及AI的变化
与CN组相比，AN组和AM组小鼠血清TC、TG、LDL-C和AI水平均明显升高(P0.05)，HDL-C水平明显降低(P0.05)。与AN组相比，AM组小鼠血清TC、TG、LDL-C和AI极显著地升高(P0.05)，HDL-C显著降低(P0.05)。SDN组与SDM组变化情况与小鼠类似。AM组小鼠的AI是SDM组大鼠的1.67倍，提示AM组小鼠的AS程度较SDM组大鼠严重，ApoE-/-更适合用于构建AS模型。见表2。
表2各组鼠的血脂和AI
与SDN组比较，aP0.05；与CN组比较，bP0.05；与AN组比较，cP0.05
2.3实验鼠血清中炎症因子的变化
与CN组相比，AM组和AN组小鼠血清中CRP、MCP-1、IL-1β、IFN-γ、TXB2和DPP-4的水平明显升高(P0.05)，PGF-1α和GLP-1水平显著降低(P0.05)。与AN组相比，AM组小鼠血清中CRP、MCP-1、IL-1β、IFN-γ、TXB2和DPP-4的水平显著升高(P0.05)，PGF-1α和GLP-1水平显著降低(P0.05)，SDM组与SDN组变化情况与小鼠类似。见表3。
表3各组鼠血清中的炎症因子
μg·L-1
与SDN组比较，aP0.05；与CN组比较，bP0.05；与AN组比较，cP0.05
2.4各组主动脉病理组织学评估
对主动脉根部病变进行评分并分级发现，SDM组大鼠1级有7只，0级有2只。而AM组小鼠1级有3只，2级有9只。AM组小鼠较SDM组大鼠相比，AS成功率高且病变严重，见表4。HE染色，SDN组大鼠和CN组小鼠主动脉根部无明显变化，内膜、中膜和外膜三层排列整齐有序，无隆起部位和斑块形成。SDM组内膜增厚且局部隆起，中膜弹力纤维紊乱，外膜有轻度炎性细胞浸润的现象，呈现早期的AS病理变化。AN组与CN组小鼠的主动脉根部大致相同，但可见内膜局部轻微隆起，有少量斑块形成。AM组内膜明显增厚，大面积隆起，形成斑块，斑块内可见大量脂质和泡沫细胞聚集，炎症细胞浸润，见图3。油红O染色，SDN组血管壁薄而透明且光滑，无粥样斑块产生，而SDM组大鼠血管壁增厚且不平整，有少量红色斑块。CN组小鼠血管壁无斑块产生，AN组有少量斑块沉积，而AM组有大量红色斑块沉积，说明模型构建成功，且AM组较SDM组AS病变严重，见图4。
表4主动脉病变分级情况
A病理切片×;B病理切片40×图3各组鼠血管组织的病理变化(HE染色)
图4各组鼠主动脉油红O染色
2.5TNF-α、StAR、PPAR-γ蛋白的表达
免疫组化结果显示，与CN组比较，AN组与AM组StAR、PPAR-γ蛋白表达水平显著降低(P0.05)，TNF-α的平均光密度值显著增加(P0.05)。与AN组比较，AM组StAR、PPAR-γ蛋白表达水平显著降低(P0.05)，TNF-α的平均光密度值显著增加(P0.05)，SDM组与SDN组变化情况与小鼠类似。见图5及表5。
图5各组鼠TNF-α、StAR、PPAR-γ蛋白的表达情况(×)
表5各组鼠TNF-α、StAR、PPAR-γ蛋白的表达情况
nmol·L-1
与SDN组比较，aP0.05；与CN组比较，bP0.05；与AN组比较，cP0.05
2.6实验鼠血清中脂肪酸的含量
与CN组相比，AN组和AM组小鼠血清中棕榈油酸甲酯、棕榈酸甲酯以及硬脂酸甲酯的含量均明显升高，差异有统计学意义(P0.05)，亚油酸甲酯和油酸甲酯的含量有所减少(P0.05)。SD大鼠情况与此类似。与AN组相比，AM组小鼠血清中棕榈油酸甲酯和硬脂酸甲酯的含量有所升高(P0.05)，亚油酸甲酯和油酸甲酯的含量明显减少(P0.05)。数据表明，AM组小鼠的AS程度更加严重，小鼠AS模型更加成功，见表6。
表6各组鼠血清中脂肪酸的含量
μmol·L-1
与SDN组比较，aP0.05；与CN组比较，bP0.05；与AN组比较，cP0.05
3讨论
高脂饲料诱导AS模型是被普遍接受的造模方法，本实验改进了高脂饲料的配方。其中，高脂饲料Ⅰ中添加丙硫氧嘧啶并用VitD3刺激，丙硫氧嘧啶可以减缓胆固醇的代谢，增加大鼠体内脂质的积累，而VitD3注射液可以促进主动脉的钙化，两者联合可以加速AS的形成[8]。实验结果表明，两种方法都造成了AS病变，但ApoE-/-小鼠造模时精神状态更好，操作更加简便，对脏器损伤较小，远远节省了时间成本。
油红O可以将主动脉壁上沉积的脂肪染成红色，作为AS的直接判断标准[9]。在本次实验中，SDM组仅有少量红色斑点，而AM组中出现大量红色斑块。HE染色可以观察到主动脉根部斑块的形成情况，实验发现，SDM组仅出现AS早期的特征，而AM组血管腔内出现突起的斑块，且有坏死、萎缩等较严重的AS病变。硬脂酸、棕榈酸和棕榈油酸为饱和脂肪酸，易造成血稠，使血液中脂质在血管壁上沉积，是致血清中TC、TG、LDL-C升高的主要原因。油酸和亚油酸为不饱和脂肪酸，可降低TC和TG，并提高HDL-C的含量，促进外周组织中胆固醇的消除，改善血液循环，具有心脏保护作用[10]。AM组小鼠脂肪酸含量的变化优于SDM组，AM组小鼠的AS程度更加严重，AM组小鼠更适合于动脉粥样硬化造模。研究[11]表明，GLP-1及其类似物能抑制巨噬细胞形成泡沫细胞，改善脂质代谢紊乱，避免脂类堆积对细胞造成损伤。DPP-4能够降低GLP-1的活性[12]，从而促进炎症反应的发生。CRP、IFN-γ、MCP-1、IL-1β等炎症因子与AS的发生发展有密切的联系[13]，通过上调黏附因子，从而促进血管平滑肌细胞异常增殖分化，进而促进AS的发生。AM组小鼠血清中CRP、MCP-1、IL-1β、IFN-γ、TXB2和DPP-4的水平升高程度明显优于SDM组大鼠，PGF-1α和GLP-1水平降低程度也高于SDM组，由此可见，AM小鼠建立AS模型更优。
StAR是TC的一种转运蛋白，参与TC的代谢，主要有两种途径[14]：一是通过线粒体转运TC合成类固醇激素，增加TC的转化；二是在肝脏中促进胆汁酸的合成，增加TC的排泄。除参与TC代谢，StAR还能抑制细胞内脂肪酸、TC合成及摄取相关基因表达，从而降低细胞内TC、脂肪酸含量。在血管内皮及巨噬细胞中有StAR的表达，其表达受TC、LDL等脂类物质以及炎症介质的调节，此外，在小鼠脑微血管内皮细胞中，游离TC也能增加StAR的表达。在巨噬细胞中StAR过表达能促进TC逆向转运蛋白ABCG1的表达而抑制巨噬细胞泡沫化，减少其在外周组织的聚集，降低形成AS斑块的风险。AM组小鼠与CN组比较，StAR蛋白表达水平显著降低，增加了形成AS斑块的风险，其StAR蛋白表达水平与SDM组相当，PPAR-γ的抗AS作用主要表现在血管炎症反应和影响血管硬化的病理过程，通过调控脂肪细胞分化和脂质代谢、抗炎、抗增殖活性来发挥作用[15]。PPAR-γ在脂肪细胞高水平表达，是脂类代谢的重要调节因子，能够参与调控脂类代谢相关基因的表达，控制脂肪储存、释放、沉积以及脂肪酸的吸收。血管内皮中StAR和PPAR-γ高表达可有效抑制AS的进程。PPAR-γ可通过调节下游多个靶点拮抗氧化LDL-C的摄入[16]，增加HDL-C并降低LDL-C的含量，从而有利于TC的逆转运，促使细胞内胆固醇外流，减少脂质聚集，从而增加斑块稳定性、延缓AS进展。PPAR-γ可通过多条信号途径抑制炎症反应，其中有一条是NF-κB炎症途径，PPAR-γ活化可抑制NF-κB下游信号表达。NF-κB通路的激活可以促进TNF-α的表达。TNF-α是炎症发展过程中的关键因子，其过表达能够诱导其他炎症因子合成及大量释放，诱导细胞凋亡或死亡，释放的炎症因子又会激活NF-κB，恶性循环，加速AS的恶化[17]。TNF-α还能加速游离脂肪酸(freefattyacid,FFA)从细胞溢出，升高血清中FFA含量，还可以使LDL生成增多滞留在血管壁，诱导内皮损伤[18]，有效上调LDL-C跨内皮细胞的细胞转运，并使LDL-C在血管内滞留，加速AS发展[19]。活化的PPAR-γ可抑制血管内皮细胞生长因子的表达，抑制平滑肌细胞增殖和新生血管形成，从而抑制AS的形成。ApoE-/-小鼠TNF-α蛋白升高，表明其AS程度更为严重，更适合于AS模型的建立。
综上所述，本实验证明采用高脂饲料诱导ApoE-/-小鼠的方法更加适合作为AS动物模型进行后续的药理学实验，血脂、炎症因子、脂肪酸以及PPAR-γ、StAR、TNF-α等蛋白均与AS有密切关系。ApoE-/-小鼠AS模型的制备为AS发病机制的研究提供了更优的动物模型，为之后的AS研究提供了更多参考。
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