来源于《中医药导报》，，27（1）
冠心病不同证候的蛋白质组学研究进展
叶嘉豪，胡志希通讯作者，杨梦，钟森杰，邱宏，熊霞*
(湖南中医药大学，湖南长沙)
冠心病是由于冠状动脉粥样硬化病变所导致血管狭窄或阻塞而引发心肌组织缺血、坏死而引起的心脏病。本病在中医学中属“胸痹、真心痛”范畴，以膻中或左胸部发作性憋闷、疼痛为主要临床表现。根据《中国心血管病报告》统计，我国目前估计心血管病现患病总人数为2.9亿，其中冠心病患者为万。冠心病中医证候分布调查显示，冠心病主要中医证候为心血瘀阻（23.75%）、痰浊内阻（20.00%）、气虚血瘀（13.75%）、气阴两虚（11.25%）、痰瘀互阻（8.75%），说明瘀、痰、气虚、阴虚在冠心病的形成中占主导地位，是导致冠心病发作的关键因素。目前蛋白质组学已广泛应用于冠心病研究中，冠心病的病理过程中伴随着蛋白质组学的改变，应用蛋白质组学有助于冠心病的诊断及辨证分型。笔者就近年来的研究进展作一综述，阐明其诊断价值，为后续研究提供借鉴。
1蛋白质组学在冠心病疾病诊断中的应用蛋白质组学通过收集冠心病患者的血浆、尿液等样本，进行蛋白质组学检测，寻找与正常个体的差异蛋白，并阐明与之相关的生物学信息。
1.1血浆蛋白质组学冠心病血浆蛋白质组学目前检测方法有同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）、液相色谱—串联质谱（LC-MS）技术等，iTRAQ技术具有分离能力强、分析范围广、结果可靠、分析时间快、自由化程度高等优点，而LC-MS技术具有灵敏度及可重复性高、价格经济等优点。区文超等运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术检测冠心病患者和健康人的血浆样本，结果发现丝束蛋白-2、膜联蛋白、凝集素、PGAM1、FGG、IGKC等存在差异。郭志鹏通过iTRAQ技术测量冠心病患者与正常人的血浆样本，结果显示，上调的差异蛋白有35个，涉及凝血因子XIIIB链、血小板因子4及分泌型卷曲相关蛋白等多个蛋白；下调的差异蛋白有41个，涉及维生素D结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及备解素等蛋白。KRISTENSENLP等运用iTRAQ技术研究冠心病患者的血浆样本，认为黏着斑蛋白可作为冠心病的一种新标记物。
目前在冠心病血浆蛋白质组学上，与健康人群比较，冠心病患者存在凝血、补体激活、脂类代谢、参与炎症反应等多个层面的生物学改变，如丝束蛋白-2可促进受损内膜聚集，继而引起冠心病的发生；膜联蛋白涉及调控细胞增殖凋亡、细胞黏附等作用，冠脉狭窄程度与其高表达相关，说明冠心病在发生发展时，存在凝血、免疫、脂质代谢等多系统紊乱。目前通过运用多种检测技术测量患者的血浆成分，能够较为全面地分析其存在差异，也为后续科研提供数据支持。
1.2尿液蛋白质组学尿液蛋白质组学相对于血浆蛋白质组学，具有采集简单、无创、容易连续性获得的优点，并且某些蛋白质由于入血后快速经肾脏代谢入尿，所以尿液蛋白质组学还能检测出某些特定的蛋白质。GISTERA等通过ELISA检测患者心肌梗死后1h的尿液，发现hh-FABP能辅助诊断超早期急性心肌梗死。LEEMY等运用LC-MS技术检测不稳定型心绞痛患者与对照组的尿液样本。结果显示：与对照组比较，冠心病患者中表达上调蛋白为CD14，并认为CD14能大规模诊断、筛查早期冠心病心绞痛患者。国外有学者通过尿蛋白质组学技术发现尿纤维蛋白、尿微量白蛋白、尿肝型脂肪酸结合蛋白等可作为临床诊断冠心病的依据。尿液蛋白质组学研究发现冠心病患者与健康人在免疫、凝血等系统存在差异，如冠心病发病时，机体纤维蛋白原水平快速升高，导致血液处于高凝状态，继而导致肾功能受损，肾小球滤过功能下降，导致出现尿微量蛋白及尿肝型脂肪酸结合蛋白等指标的异常，因此可以通过尿液蛋白质组学技术辅助冠心病的诊断。
2冠心病中医证候蛋白质组学研究蛋白质组学可为冠心病的诊断治疗提供辅助依据，同时也为中医学研究冠心病“证”之间存在的差异提供了技术支持。对不同证候的样本进行蛋白质组学研究，筛选出差异蛋白，可研究该蛋白能否作为该证候诊断的金标准。
2.1冠心病“实证”蛋白质组学研究冠心病是本虚标实、虚实夹杂的复合性疾病，标实以血瘀、痰饮、痰瘀为主，其中血瘀是冠心病致病的关键，也是冠心病最常见、最多发的中医证型。痰证和痰瘀互结证在发病早期所占比例较少，但随着病情的演变，中后期以痰证和痰瘀互结证为主。
2.1.1血瘀证冠心病血瘀证为目前研究热点之一，研究发现与正常人比较，血瘀证存在凝血功能异常、血脂异常及炎症反应异常，具体表现为全血黏度增高，血小板活化，血流动力降低，血液处于高凝状态。以上可作为冠心病血瘀证辨证的依据。李雪峰等运用MALDI-TOF-MS技术检测冠心病心血瘀证患者与正常患者的血浆样本，发现CD41和Actinγ等7种差异蛋白，并认为CD41和Actinγ有望成为冠心病心血瘀证的标记蛋白。周倩倩等通过MALDI-TOF-MS技术检测冠心病心血瘀证患者和正常人的血浆样本，发现差异蛋白为视*醇结合蛋白、结合珠蛋白、血清白蛋白、载脂蛋白。赵慧辉等应用HDMS与UPLC联用检测冠心病心血瘀证患者和健康人血浆样本，发现上调蛋白13种，根据功能分为急性时相反应蛋白、补体蛋白、细胞骨架蛋白、凝血相关蛋白；下调蛋白12种，根据功能分为载脂蛋白、运输蛋白、抗凝血相关蛋白、免疫球蛋白、细胞骨架调控蛋白。肖隋熙应用iTRAQ技术检测78例冠心病心血瘀证患者和34例冠心病非心血瘀证患者的血浆差异蛋白质，发现11个上调的差异蛋白和16个下调的差异蛋白。其差异蛋白功能主要涉及细胞迁移、细胞损伤表达、细胞变性等。
以上研究分别运用MALDI-TOF-MS技术、iTRAQ技术、HDMS与UPLC联用技术，检测冠心病血瘀证与正常模型组的血液样本，并发现其差异涉及炎症反应、凝血功能、免疫反应、脂质代谢等，具体差异蛋白为CD41、视*醇结合蛋白、结合珠蛋白、血清白蛋白、载脂蛋白等。说明在疾病初期血瘀证阶段，其病理改变以凝血、炎症、免疫、脂质代谢等通路紊乱为主。瘀血阻滞，导致血液黏稠度增加、微循环障碍，血流不畅，瘀阻心脉，最终导致了冠心病的发生。
2.1.2痰证冠心病痰证与血瘀证的共同特点为凝血、脂质代谢紊乱，但两者在蛋白质组学表达方面均有侧重，痰证以脂质代谢异常所导致的“高脂”为主要特点，血瘀证以凝血系统紊乱为主。朱明丹等采用ESI－MS技术对冠心病心气虚证、心肾阴虚证、痰浊内阻证、心血瘀证各9例患者的血清样本进行蛋白质组学研究，发现与血瘀证比较，痰证上调蛋白为血清淀粉样P物质、载脂蛋白E、凝溶胶蛋白亚型1、巨噬细胞刺激蛋白1、载脂蛋白H，下调蛋白为α-2-巨球蛋白、补体C4、补体成分C3、抗凝血酶Ⅲ。宋剑南等利用双向凝胶电泳-质谱技术检测痰证、血瘀证、痰瘀证患者和正常人的血浆样本，发现痰证与血瘀证的差异蛋白为结合珠蛋白前体、肾上腺髓质素结合蛋白前体、白蛋白、补体C4。
冠心病痰证主要体现在脂质代谢（载脂蛋白E、载脂蛋白H等）、免疫系统（巨噬细胞刺激蛋白1）、凋亡系统（凝溶胶蛋白亚型1）异常，而血瘀证主要体现在补体（补体C4、补体成分C3）、凝血系统（抗凝血酶Ⅲ）等异常。
2.1.3痰瘀互结证痰瘀互结证与痰证、血瘀证比较，其特点表现为凝血、脂质代谢进一步紊乱，血液处于高凝、高脂状态，血流动力进一步降低。“高脂、高凝”可能为冠心病痰瘀互结证的特点。苗兰等采用双向凝胶电泳、基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术检测小型猪冠心病痰瘀证的心肌组织，结果显示：与正常组比较，小型猪冠心病痰瘀证载脂蛋白E升高，补体C4降低。宋剑南等发现与痰证比较，痰瘀互结证的上调蛋白为纤维蛋白原β链、白蛋白、补体C4、血红蛋白结合蛋白前体、结合珠蛋白前体，下调蛋白为载脂蛋白AI前体、α-1抗胰蛋白酶片段、簇连蛋白前体等。说明痰瘀互结证、痰证差异蛋白体现在凝血系统（纤维蛋白原β链）、补体系统（补体C4）、脂质代谢（载脂蛋白AI前体、载脂蛋白E）、血浆转运蛋白（白蛋白）、炎症反应相关蛋白（α-1抗胰蛋白酶片段、血红蛋白结合蛋白前体）等方面。
从初期的血瘀证到中期的痰证及痰瘀互结证，冠心病主要以脂质代谢指标升高、凝血等指标下降为主要表现。该结论可能与疾病的传变存在一定关联，血瘀证引起气血的停滞，气滞无力推动津液运行，或血瘀迫津外出，导致痰浊的内停；而痰浊内停也会引起气血津液的停滞，最终引起血瘀证的发生或加重，两者导致疾病螺旋发展，最终形成“痰瘀互结证”。“痰”和“瘀”在病理上互有侧重，如痰证在脂质代谢异常方面较明显，可能由于痰浊内停，损伤脾阳，导致运化功能失常，从而导致人体脂质代谢功能的紊乱；而凝血系统异常主要以血瘀证、痰瘀互结证较明显，可能因为血瘀导致气血流动不畅，血流动力下降引起血液黏稠，进而导致凝血、补体指标升高。
2.2冠心病“虚证”蛋白质组学研究冠心病病机为本虚标实、虚实夹杂，本虚以心气虚证、心肾阴虚证为主，其发病初期比例低于血瘀证，但是随着疾病的发展，后期主要以心肾阴虚证、气虚证等虚证为主。
2.2.1心肾阴虚证王刚等采用荧光差异蛋白电泳、质谱技术检测冠心病心血瘀证与心肾阴虚证患者的血浆差异蛋白，结果显示：与心肾阴虚证比较，心血瘀证患者的α2巨球蛋白、载脂蛋白A1、载脂蛋白E、补体C3、补体C1q亚成分亚基C、血红素结合蛋白和激肽酶蛋白含量较高，而聚集素、血清淀粉样P物质含量较低。朱明丹等发现，与心肾阴虚证比较，冠心病血瘀证的上调蛋白为血红素结合蛋白、载脂蛋白E、α2巨球蛋白、载脂蛋白A-I、补体C1、载脂蛋白4前体、补体C3、激肽酶-1蛋白，下调蛋白为聚集素、血清淀粉样P物质。上述2项研究结果大致相同，说明冠心病心肾阴虚与血瘀证的差异蛋白为补体C3、补体C1、载脂蛋白A1、载脂蛋白4前体、载脂蛋白E、α2巨球蛋白、激肽酶-1蛋白、血红素结合蛋白、聚集素、血清淀粉样P物质，其差异蛋白主要涉及补体系统（补体C3、补体C1）、脂质代谢（载脂蛋白A1、载脂蛋白4前体、载脂蛋白E）、激肽释放酶-激肽系统（激肽酶-1蛋白）、阿尔茨海默信号通路（聚集素、血清淀粉样P物质），可用于作为辨别心血瘀证与心肾阴虚证的指标，同时其含量的降低可能为心肾阴虚证形成的内在基础。
2.2.2心气虚证袁宏伟等采用双向电泳-质谱技术对冠心病心气虚证和心肾阴虚证患者的血浆进行分析，结果显示，与心肾阴虚证比较，心气虚证患者的上调蛋白为血红素结合蛋白、补体C7、补体C3、补体C4-A、凝血酶原、血浆血管舒缓素，下调蛋白为α2巨球蛋白、富含组氨酸糖蛋白、载脂蛋白4前体、甘露糖结合蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白A-I、活化T细胞核因子5亚型b、纤溶酶原、补体因子H亚型1。朱明丹等发现，与心血瘀证比较，气虚证患者的上调蛋白为补体C3、α2巨球蛋白、补体C4-A、血红素结合蛋白、补体C7、结合珠蛋白亚型1、血浆血管舒缓素、抗凝血酶Ⅲ，下调蛋白为CPN1、羧肽酶N催化链、聚集素。
以上2项研究说明气虚证补体C3、补体C4-A、补体C7、血红素结合蛋白、血浆血管舒缓素的含量低于血瘀证、心肾阴虚证；差异指标主要涉及补体（补体C3、补体C4-A、补体C7）、激肽系统（血浆血管舒缓素）及炎症反应相关蛋白（血红素结合蛋白）；血瘀证、气虚证以上指标存在一定差异，可能为初期以血瘀证为主，血瘀导致气血津液的停滞，故会导致补体、激肽、免疫系统异常，以及炎症相关蛋白、脂质代谢紊乱等蛋白质异常；而血瘀日久，耗伤正气，最终由实转虚，属于由实转虚的过程，故其病理特点并非器质性病变，而是以气虚无力固摄血液的生理性改变，故凝血因子含量会有所下降；同时气虚不能固表，卫气亏虚导致了自身免疫功能下降，推断出冠心病后期气虚证的主要特征为炎症反应、免疫系统、脂质代谢等方面的蛋白质含量降低。
2.3总结目前冠心病中医证候蛋白质组学在实验中已经初步揭示出正常人、冠心病患者及其不同证型之间的差异蛋白，一定程度上说明蛋白组学与中医证候演变的相关性，可为以后研究疾病演变规律及证的本质研究提供数据基础。蛋白质组学虽能检测出差异蛋白，但是目前技术仍存在一定局限性。
3该领域所存在的问题及可能的解决方法3.1规范证候诊断目前蛋白质组学实验设计方案复杂多样，如证候存在规范标准问题，且证有兼夹，证与证之间存在轻重、先后、主次、标本之别。因此，蛋白质组学检测不能避免由于样本、动物模型、造模方式、检测技术方法所导致的蛋白差异，即使筛选出不同证型的差异蛋白，但不能确定其与证候间的关联程度。其次目前已经开展了大量蛋白质组学实验，但对于每个证的蛋白组“金标准”还没有确定等。针对以上研究问题，笔者认为，要进一步完善蛋白质组学的相关技术，制订相应的国家、行业技术标准，严格设计调查方案和标准操作规程，控制所有可能影响结果的因素，实验以人作为对象应尽量控制年龄、环境、基础病、人种、居住地、社会压力、生活方式等所产生的差异；对于实验动物应严格控制造模方式、检测技术、种类、数据处理的方法等；开展大规模、大样本的临床研究，增加样本量，从中获得大量高质量、可信度高的数据；重复实验，验证结果，进一步完善和制定符合临床实际的证候诊断标准，最终得到其证候诊断的金标准。
3.2优化研究设计冠心病蛋白质组学研究多集中于单一证型上，而中医证型往往存在证候错杂，单一证型不能满足中医证候的复杂性；目前的研究缺乏对中医异病同治的深入探讨，缺乏了对于疾病综合了解。笔者认为，可以根据西医冠心病辨病分期及中医辨证分型，进行样本再细化，满足中医证型上复杂性，更深层次挖掘中医证候的本质。
3.3创新技术手段目前中医对蛋白质组学还存在这一些问题，如对海量信息的分析处理能力、对小分子蛋白处理能力不足等。笔者认为，目前应开展多组学技术相互联用，整合分子生物学、生物信息学，并建立完善冠心病证型相关的数据库，如“冠心病证候—蛋白质表达谱”，结合统计学进行分析，最后通过网络药理学、Meta分析进行综合评价，引入权重量化概念，通过不同的蛋白加权，筛选出区分中医证型标记物及明确各差异蛋白与证候的关联程度，为冠心病诊治提供科学依据，降低临床误诊率及患者发病率，提高诊疗效率及患者生活水平，推动中医药精准治疗进程，为中医药迈向世界提供实验数据支持。
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